Primer
- För andra betydelser, se Primer (olika betydelser).
Primer (inom molekylärbiologi) är en kort enkelsträngad nukleinsyrasekvens som fungerar som startpunkt för DNA-syntes. Primern är nödvändig för DNA-replikation eftersom enzymet DNA-polymeras, som katalyserar denna process, endast kan addera nukleotider till en redan existerande DNA-sträng. DNA-polymeras startar replikationen vid 3' änden av primern och använder den motsatta strängen som mall för att skapa en ny komplementär sträng. I de flesta fall av naturlig DNA-replikation utgörs primern av en kort RNA-sträng.[1]
Många laborativa tekniker inom molekylärbiologi och bioteknik vilka involverar DNA-polymeras, såsom DNA-sekvensering och PCR, kräver DNA-primers. Dessa primrar är vanligtvis korta syntetiska oligonukleotider, med en längd på cirka 20 baser. Primrarna är designade för att binda till en önskad DNA-sekvens, vilken sedan kan kopieras med hjälp av polymeraset.[1]
Mekanism in vivo
redigeraPrimrar används in vivo för DNA-replikation av den så kallade lagging strand, den sträng som är orienterad i riktning 5'→3'. Denna strängs komplement måste därför bli sytetiserad i 3'→5' riktning, eftersom DNA är antiparallel. Eftersom DNA-polymeras endast är verksam i riktning 5'→3', syntetiseras lagging strand i korta fragment, så kallade Okazaki fragments. Detta sker genom att enzymet primas skapar RNA-primerar, DNA-polymeraset kan använda för att förlänga strängen i riktning 5'→3'.[2]
RNA fragmenten avlägsnas sedan och deoxyribonukleotider adderas för att fylla mellanrummen mellan Okazaki fragmenten.[3]
Avlägsnande av primer
redigeraI prokaryota celler avlägsnas RNA-primrarna med hjälp av RNas H, ett enzym som bryter ner RNA, samt polymeras I. Polymeras I har förmåga att hydrolysera fosfodiesterbindningar i RNA och därmed avlägsta nukelotider från 5'-änden av primern. RNA-primern ersätts sedan av deoxyribonukelotider för att skapa fragment enbart bestående av DNA.[2]
I eukaryota celler förlänger DNA-polymeras δ Okazaki fragmenten i riktning 5'→3'. När polymeraset når RNA-primern från det föregående Okazakifragmentet ersätter enzymet 5'-änden av primern med ett enkelsträngat överhäng, vilket sedan avlägsnas genom klyvning med hjälp av exonukleas. DNA-polymeras δ förlänger Okazakifragmenten och DNA-ligas sammanfogar fragmenten genom att skapa fosfodiesterbindningar.[3]
Användande av syntetiska primrar
redigeraDNA-sekvensering används för att bestämma ordningen av nukleotider i en DNA-sekvens. Sanger chain termination method är en metod för sekvensering, som använder primrar för att starta reaktionen.[4]
I PCR används primrar för att specificera vilken DNA-sekvens som skall amplifieras. Längden på primrarna är oftast 20-30 nukleotider, och designas för att binda till början respektive slutet av den sekvens som önskas amplifieras. DNA-polymeras syntetiserar sekvensen genom att förlänga primern. De nya DNA-fragmenten används sedan som mall för ytterligare amplifiering, vilket leder till en exponentiel ökning av den önskade DNA-sekvensen.[5]
Design av primrar för PCR
redigeraFör PCR krävs två olika primrar som binder till början respektive slutet av den DNA-sekvens som önskas amplifieras. Dessa två primrar behöver ha liknande smältpunkt eftersom båda primrarna ska binda till DNA-templatet samtidigt under PCR-reaktionen. [6]
För att undvika amplifiering av en felaktig sekvens, behöver primrarna designas så att dessa endast kan binda till DNA-templatet vid önskad position. Primrana ska inte heller ha förmågan att enkelt kunna binda till sig själva eller andra primrar i lösningen, då detta kan förhindra att primrarna binder till templatet eller att provet blir kontaminerat.[6]
Källor
redigera- ^ [a b] ”primer | Learn Science at Scitable”. www.nature.com. http://www.nature.com/scitable/definition/primer-305. Läst 22 juni 2015.
- ^ [a b] Cooper, Geoffrey M. (på engelska). DNA Replication. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9940/. Läst 22 juni 2015.
- ^ [a b] ”Distinguishing the pathways of primer removal during Eukaryotic Okazaki fragment maturation”. urresearch.rochester.edu. https://urresearch.rochester.edu/institutionalPublicationPublicView.action?institutionalItemId=6071&versionNumber=1. Läst 22 juni 2015.
- ^ ”DNA Sequencing”. www.ocf.berkeley.edu. https://www.ocf.berkeley.edu/~edy/genome/sequencing.html. Läst 22 juni 2015.
- ^ ”Polymerase Chain Reaction (PCR)”. www.ncbi.nlm.nih.gov. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techpcr/. Läst 22 juni 2015.
- ^ [a b] C W Dieffenbash, T M Lowe, G S Dveksler (1993). ”General concepts for PCR primer design”. Genome Research 3: sid. 30-37. http://www.nature.com/scitable/content/general-concepts-of-primer-design-8942407. Läst 22 juni 2015.